首先，DNA成為單鏈?zhǔn)且锟梢皂樌Y(jié)合的前提，如果沒有經(jīng)過充分的解旋，擴(kuò)增效率肯定會(huì)大受影響（等溫?cái)U(kuò)增不在此列）。比如擴(kuò)增cDNA變性大概10sec就夠，擴(kuò)增質(zhì)粒則往往要30sec及以上。

其次，熒光探針需要先于引物結(jié)合到模板上，不論是水解探針還是蝎形探針。否則就會(huì)出現(xiàn)變性好的單鏈DNA在引物和酶的作用下都已經(jīng)補(bǔ)齊了另一條鏈了，探針還在一邊傻傻的說：“我沒上車啊~"

最后，常規(guī)的qPCR擴(kuò)增片段一般在200bp左右，延伸時(shí)間設(shè)定30-45sec也基本夠用。至于說延伸溫度，多會(huì)把退火和延伸合并為一步，溫度采用60℃。但是有些反應(yīng)，因?yàn)檎w的反應(yīng)優(yōu)化不太理想或者是反應(yīng)自身的一些固有限制，兩步法擴(kuò)增的效果不夠好，此時(shí)可以使用三步法擴(kuò)增，提高產(chǎn)物積累。采用三步法擴(kuò)增時(shí)有個(gè)值得推敲的點(diǎn)，信號(hào)收集該是在退火階段還是延伸階段？染料法、水解探針、蝎形探針的答案并不一樣，可自行推導(dǎo)一番然后理論聯(lián)系實(shí)際驗(yàn)證一下。