PCR技術(shù)是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理，用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。而熒光PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種更加準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)方法，在寵物疾病診斷等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。寵物檢測(cè)熒光PCR的基本工作原理：
 

　　1.DNA解鏈：在95℃左右的高溫下，DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂，解開(kāi)成為兩條單鏈，這一步是為后續(xù)引物與模板的結(jié)合以及新鏈的合成做準(zhǔn)備。
 

　　2.引物結(jié)合：溫度降低到60℃左右時(shí)，人工合成的一對(duì)特異性引物會(huì)分別與DNA單鏈上的特定互補(bǔ)序列相結(jié)合，為DNA聚合酶提供起始點(diǎn)，以便開(kāi)始合成新的DNA鏈。
 

　　3.延伸合成：當(dāng)溫度升至72℃左右時(shí)，DNA聚合酶以dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸)為原料，沿著模板鏈延伸，合成出一條與模板DNA互補(bǔ)的新鏈，從而使目標(biāo)DNA片段的數(shù)量得到增加。
 

　　4.重復(fù)循環(huán)：上述三個(gè)步驟不斷重復(fù)進(jìn)行，經(jīng)過(guò)多個(gè)循環(huán)后，微量的初始DNA片段被大量擴(kuò)增，使得原本難以檢測(cè)的微量DNA變得易于檢測(cè)。
 

　　5.熒光信號(hào)檢測(cè)：在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，體系中的熒光基團(tuán)受到激發(fā)會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，并且隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增多，熒光信號(hào)也會(huì)逐漸增強(qiáng)。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)這些熒光信號(hào)的變化情況，就可以確定PCR擴(kuò)增是否達(dá)到了預(yù)期的程度，進(jìn)而判斷樣本中是否存在特定的病原體或基因序列。

 

　　寵物檢測(cè)熒光PCR的使用注意事項(xiàng)：
 

　　1.分區(qū)操作
 

　　-嚴(yán)格執(zhí)行試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增/產(chǎn)物分析區(qū)的分區(qū)管理。各區(qū)物品嚴(yán)禁混用，并在操作前開(kāi)啟UV燈照射消毒。
 

　　2.防止污染
 

　　-勤換手套，接觸不同區(qū)域或可疑污染源后立即更換新手套；使用帶有濾芯的吸頭以避免交叉污染。
 

　　-禁止用移取PCR產(chǎn)物的移液器接觸試劑或其他關(guān)鍵成分。
 

　　3.試劑保存和使用
 

　　-熒光PCR試劑應(yīng)在冰浴條件下分裝和配制反應(yīng)體系，以保持活性。反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致酶活性下降，因此應(yīng)盡量避免。
 

　　-不同批號(hào)的試劑不宜混合使用，且需按照說(shuō)明書(shū)要求的順序加入試劑。
 

　　4.樣品處理
 

　　-為防止RNA降解，樣品處理應(yīng)在低溫環(huán)境下進(jìn)行，并且盡快完成操作。
 

　　-組織樣品需經(jīng)過(guò)研磨、離心等步驟提取核酸，全血樣本則需待血凝固后取血清進(jìn)行處理。